植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)是一种兼性异型乳酸菌，广泛存在于环境、人体胃肠道和发酵蔬菜食品中。近年来，大量研究表明，植物乳杆菌是一种多功能益生菌，具有抗氧化、降解胆固醇、维持宿主肠道菌群平衡和提高人体免疫等功能[1-2]。Choi等[3]从泡菜中分离出一株植物乳杆菌EM，经研究发现具有降低血胆固醇的作用。Wang等[4]的研究发现，植物乳杆菌LPL-1能合成具有抗菌活性的植物乳杆菌素，可以有效代替抗菌素抑制致病菌的生长。由于植物乳杆菌的益生特性，使其在食品和医用等领域都有广泛应用。 近年来高通量测序技术的不断发展进步，为研究人员开拓了一个全新的研究方向。2004年第1株分离自人体口腔的植物乳杆菌WCFS1完成全基因组测序后，截至2022年8月，已有超过100株植物乳杆菌完成全基因组测序[5]。而现有的生理生化方法对植物乳杆菌潜在益生特性的研究已十分有限，通过全基因组测序探究基因组与潜在益生特性之间关系，是一条筛选优质益生菌菌株的有效途径[6]。有研究指出，植物乳杆菌EM是一株具有抗菌活性、降胆固醇和耐酸胆汁的益生菌，通过全基因组分析其包含耐酸耐胆盐、耐温耐氧化等基因发现，其同时含有与抗菌活性相关的抗菌素基因簇以及与降低血清胆固醇相关的胆盐水解酶基因[7]。 本团队前期从四川多代泡菜中分离出114株植物乳杆菌，并对其生物特性和安全性进行评价，最终得到13株具有潜在益生特性的植物乳杆菌，从中选取2株植物乳杆菌Eden-Star PC06和Eden-Star PC108进行全基因组测序，其中Eden-Star PC06耐酸耐胆盐能力较为突出，而Eden-Star PC108拥有较强的自聚集和共聚集能力。本研究中完成图采用二代与三代结合即Illumina HiSeq+PacBio的测序方式，每个样品同时提供不低于基因组100×的PacBio测序数据和100×Illumina测序数据，保证更完整更精确的组装，完成图可以避免小质粒( < 15 kb)信息的丢失，保证获得包含质粒的完整基因组。利用比较基因组和功能基因注释等方法，从基因组水平上揭示菌株间的差异，并进一步挖掘其益生相关功能基因，以判断菌株作为益生菌菌株的潜力，同时为选优良益生菌菌株和评价其益生特性提供遗传学基础。 1 材料与方法 1.1 实验菌株信息 本研究测定的2株L. plantarum Eden-Star PC06 (下文中简称为PC06)和Eden-Star PC108 (下文中简称为PC108)由四川益动源生物科技有限公司保藏，均分离自四川多代泡菜，已在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbial Culture Preservation and Management Center, CGMCC)注册专利，保藏号分别为No. 25060和No. 25061。项目已上传国家微生物科学数据中心(National Microbiology Data Center, NMDC)，项目编号(NMDC accession)为NMDC10018235，基因组编号(accession number)分别为NMDC60045920和NMDC60045921。 本研究选取12株完成全基因组完成图且有研究报道具有益生特性的植物乳杆菌作为参考菌株(表 1)，参与比较基因组的菌株信息均来自NCBI (National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) GenBank数据库。 1.2 全基因组测序和组装 全基因组由上海美吉生物医药科技有限公司基于Illumina HiSeq和PacBio Sequel平台进行测序。细菌基因组扫描图是利用短序列组装软件SOAPdenovo2 ()对二代测序后的优化序列进行多个Kmer参数的拼接，得到最优的contigs组装结果，然后把reads比对到contig上，根据reads的配对端(paired-end)和重叠(overlap)关系，对组装结果进行局部组装和优化，形成scaffolds。细菌基因组完成图利用组装软件Unicycler[8]进行三代序列组装，组装过程中会借助Pilonjin软件进行序列校正，如果最终组装序列两端存在一定长度以上的overlap，则将序列成环并截去其中一端overlap序列[9]。最终可得到完整的染色体及质粒序列。 1.3 全基因组特征预测 利用Glimmer ()、GeneMarkS、Prodigal软件对基因组中的编码序列(coding sequence, CDS)进行预测。扫描图组装结果默认使用Glimmer进行预测，完成图组装结果默认使用Glimmer预测染色体基因组，使用GeneMarkS预测质粒基因组[9]。利用tRNAscan-SE v2.0软件()对基因组中包含的tRNA进行预测，可以获得每个样本基因组中tRNA的核苷酸序列信息，反密码子信息及二级结构信息。利用Barrnap软件(https://github.com/tseemann/barrnap)对基因组中包含的rRNA进行预测，获得每个样本基因组中所有rRNA的种类、位置、序列信息[10]。最后采用CGView绘制基因组圈图。 1.4 构建系统发育树 对本研究中2株植物乳杆菌和12株参考菌株进行系统发育分析，利用MEGA X软件基于16S rRNA基因序列构建邻接(neighbor-joining, NJ)树，参数bootstrap值设为1 000。 1.5 平均核苷酸一致性(ANI)分析 平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)是基于两两基因组之间所有直系同源核苷酸序列比较的一个平均值，主要用于在全基因组水平评估物种间的亲缘关系。本研究利用软件PYANIV0.2.10 (https://github.com/widdowquinn/pyani.git)计算L. plantarum PC06和L. plantarum PC108与参考菌株之间的相似性并绘制聚类热图。 1.6 基因组功能注释与分析 使用Diamond和blast2go软件分别通过COG (clusters of orthologous groups)、KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)和CAZy (carbohydrate-active enzymes)数据库进行功能基因注释。使用VFDB (virulence factors database)数据库核心数据集(setA)和完整数据集(setB)中14个基础毒力因子类别对细菌所有基因组进行毒力因子预测，采用严格参数(相似性 > 80%，覆盖率 > 60%，E值≤1e-5)和一般参数(相似性 > 30%，覆盖率 > 70%，E值≤1e-5)[11]。使用CARD (comprehensive antibiotic resistance database, )耐药基因标识符(RGI)软件(CARD比对条件设置为loose)[11]从细菌基因组序列中预测抗微生物耐药性(AMR)基因，提供由抗生素耐药性本体(ARO)分类标签和抗生素耐药基因(ARG)注释以初步评估菌株的安全性。此外，利用BLAST软件与参考菌株L. plantarum WCFS1进行对比，挖掘胃肠道耐受性相关基因；利用BAGEL4 ()在线分析软件对基因组序列进行产植物乳杆菌素相关基因簇的挖掘，综合分析益生相关基因以初步探究其益生潜力。 2 结果与分析 2.1 植物乳杆菌PC06和PC108全基因组概况 对测序样品L. plantarum PC06和PC108进行数据评估和序列组装，得到基因组组装结果(表 2)和基因组基本特征(表 3)。 测序结果显示，L. plantarum PC06全基因组包含1个片段长度为3 163 902 bp的环状染色体，其GC含量为44.68%，含6个完整质粒，其序列长度和GC含量分别为67 746 bp和38.30%、61 375 bp和39.23%、40 384 bp和36.68%、6 143 bp和36.82%、3 516 bp和37.32%、2 042 bp和37.95%。L. plantarum PC06预测有3 161个编码基因。 L. plantarum PC108全基因组包含1个片段长度为3 205 054 bp的环状染色体，其GC含量为44.67%，含5个完整质粒，其序列长度和GC含量分别为49 882 bp和41.79%、35 865 bp和39.79%、34 459 bp和41.37%、9 568 bp和36.95%、9 450 bp和35.95%。L. plantarum PC108预测有3 197个编码基因。 针对L. plantarum PC06和PC108组装的基因组序列，利用GCView对染色体(chromosome, Chr)进行绘制，包含全部基因、COG注释基因、prophage、CRISPR、ncRNA、GC含量以及GC skew结果。其图谱见图 1。 2.2 系统发育树构建 为了探究L. plantarum PC06和PC108两株菌与其他具有益生特性的12株L. plantarum之间的关系，基于16S rRNA基因构建包含PC06、PC108以及12株参考菌株的系统发育树(图 2)。发现PC06与EM和CAUH2具有较近的亲缘关系，EM和CAUH2的来源均为泡菜。PC108与JDM1和ZJ316亲缘关系较近，而JDM1与ZJ316均来源于人体，从系统发育树中也可看出PC06与PC108亲缘关系相距较远，这意味着PC108可能往更适应人体环境的方向进化。 2.3 平均核苷酸一致性(ANI)分析 ANI是基于两两基因组之间所有直系同源核苷酸/氨基酸序列比较的一个平均值，主要用于在全基因组水平评估物种间的亲缘关系，反映基因组之间进化距离关系，一般认为ANI≥95%为同种[12]。 本研究对14株植物乳杆菌全基因组序列进行ANI分析，并绘制了聚类热图(图 3)。结果显示全部菌株之间ANI均大于98.8%，可从基因组层面上确认PC06和PC108为植物乳杆菌，且不同植物乳杆菌基因组间存在差异。其中PC06和PC108之间ANI为99.05%；PC06和EM的ANI最高为99.84%；PC108和ZJ316的ANI最高为99.56%。 2.4 基因组功能注释与分析 2.4.1 COG数据库注释 COG数据库可将蛋白功能划分为26类，每一类都是由直系同源序列构成。通过比对蛋白序列，将其注释到某一COG分类中，用以推测该序列的功能[13]。L. plantarum WCFS1是目前研究最深入的植物乳杆菌之一，有较高的参考价值，同时其具有较强的胆盐耐受能力，能在人体肠道存活和定殖[14]，具有较高的益生潜力。因此，以L. plantarum WCFS1作为参考菌株能一定程度上加深对L. plantarum PC06和PC108的了解。 L. plantarum PC06和PC108在COG数据库中分别得到了2 480个和2 508个功能基因注释，占CDS的78.46%和78.45%。注释结果显示(表 4)，L. plantarum PC06碳水化合物转运和代谢(G)相关基因得到了最多注释量，达到294个；而L. plantarum PC108转录(K)得到的基因注释量最多，有262个；同时一般功能预测(R)和氨基酸转运及代谢(E)相关功能蛋白也得到了较高的基因注释量，意味着这2株菌具有较强的利用碳水化合物和氨基酸的能力。除此之外，这2株菌还在细胞壁、生物膜和包膜生物发生中分别获得172个和169个基因注释量，可以辅证这2株菌可能具有较强的生物膜形成能力，并且防御机制的注释量分别为73个和87个，表明它们可能具有一定的抵抗外界环境潜力，但基因是否能表达需后续研究验证。 L. plantarum PC06和PC108在碳水化合物转运和代谢(G)、氨基酸转运及代谢(E)和转录(K)上得到了和L. plantarum WCFS1相近的基因注释量，意味着可能在这些方面有着和WCFS1相似的能力。与L. plantarum WCFS1相比，L. plantarum PC06和PC108关于前噬菌体和转座子(X)的功能蛋白得到了较多注释，这意味着PC06和PC108有获取外源基因片段的能力，而这能帮助细菌适应环境的变化或提高自身的生存竞争力，从而占据优势生态位。 2.4.2 KEGG数据库注释 KEGG数据库整合了多方面的数据，可用于系统分析基因表达产物的功能及代谢途径[15]。绘制的KEGG数据库注释结果见图 4，L. plantarumPC06和PC108分别有2 867个和2 822个基因在KEGG数据库中得到功能注释。在KEGG注释中PC06和PC108有相似的表现，大部分基因被注释到各个代谢通路，主要分布于全局和概述图谱，其次碳水化合物代谢以及氨基酸代谢，碳水化合物代谢通路包括各种糖类的代谢通路。环境信息处理中得到最多注释的是膜运输，主要集中于ABC转运蛋白、磷酸转移酶系统以及细菌分泌系统。值得一提的是，L. plantarum PC06和PC108在人类疾病方面得到注释的基因较少，主要是抗菌药物抗性。 2.4.3 CAZy数据库注释 CAZy是关于合成或分解复杂碳水化合物和糖复合物酶类的专业数据库[16]。碳水化合物在很多生物学功能中具有重要地位，通过研究碳水化合物相关酶可以得到大量有意义的生物学信息。在CAZy注释结果中(图 5)，L. plantarum PC06和PC108在糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GHs)上得到了最高的注释量，分别为43.27%和44.76%，其次是糖基转移酶(glycosyl transferases, GTS)。糖苷水解酶作用于含有2个及以上1, 4-α-d-葡萄糖基的多糖中的1, 4-α-d-葡萄糖苷键，多糖水解过程释放大量能量，进而支撑细菌的各种活动。糖基转移酶利用活化的供体形成糖苷键，将糖转移到特定的受体如蛋白质、脂质或其他聚糖上，形成新的聚合物从而参与各种生理过程[17]。碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases, CEs)也得到了部分注释，能催化各种碳水化合物底物的去酯化，而辅助活性酶(auxiliary activity enzymes)包括一大类作用于碳水化合物的氧化还原活性酶[18]。 2.4.4 VFDB数据库注释 VFDB是全面的一体化的病原菌毒力因子信息管理网络数据库。来源于微生物，并对微生物自身侵染和引起特定宿主疾病具有促进作用的物质称为毒力因子，主要包括细菌毒素、调节细菌黏附作用的细胞表面蛋白、对细菌本身具有保护作用的蛋白、细胞表面碳水化合物以及具有细菌致病性的水解酶等[19]。 使用严格标准在VFDB数据库中比对后未发现毒力因子。使用一般标准时，L. plantarum PC06和PC108分别得到99个和97个有明确分类的基因注释量(图 6)，其中主要涉及铁离子摄取系统、细菌黏附与定殖和抗吞噬。铁是绝大多数细菌生存所必需的营养物质，2株菌均在铁离子摄取系统中得到了大量的基因注释，意味着PC06和PC108可能有着较强的铁离子吸收利用能力以提升其生存能力。L. plantarum PC06和PC108在抗吞噬作用上也得到了较多的注释量，抗吞噬的毒力因子能够帮助细菌对抗宿主免疫防御系统从而免于清除[20]。同时与定殖相关的基因也得到了较多注释，例如在L. plantarum PC06和PC108中找到了3种与黏附性有关的基因(VF0349、VF0327和VF0014)，而这些基因在细菌中广泛存在，同源基因比对结果发现植物乳杆菌WCFS1、NL42等菌株均有以上基因[14, 21]，而这些基因使菌株拥有与其他细胞黏附或让细胞相互黏附的能力，并非具有毒力效应。值得一提的是，在PC108中存在2个VF0014基因，位于不同的基因片段上，这可能会导致PC108的自聚性强于PC06，与团队之前的研究结果相吻合[22]。事实上这些基因在毒力因子数据库中被鉴定为毒力因子，因为它们也参与敌对/宿主环境中的致病细菌适应、存活或附着。然而，如果无其他发病机制，这些基因可以被认为是对细菌有益的，因为它们增加了细菌适应性，并且在需要细胞存活能力的情况下是可被接受的(例如增殖培养益生菌等)。 此外，在这些基因中检测出了毒力因子溶血素Ⅲ (VFG038904)和β-溶血素(CVF171)，事实上该基因在几种商业益生菌中也有报道，例如批准的公认安全(generally regarded as safe, GRAS)益生菌菌株植物乳杆菌299 V，中国广泛使用的商业益生菌植物乳杆菌JDM1，泡菜益生菌植物乳杆菌ST-III等，但团队前期研究证明L. plantarum PC06和PC108不具有溶血性[22]。 2.4.5 CARD数据库注释 CARD广泛包含来自各种生物体、基因组、质粒的抗生素抗性相关的参考基因，可用于指导环境、人体、动物菌群耐药组和抗生素抗性机制研究[23]。 L. plantarum PC06与PC108从CARD数据库中共计得到了154个和156个抗生素抗性基因注释。结果显示(图 7)，L. plantarum PC06与PC108对大环内酯类抗生素、四环素类抗生素和氟喹诺酮类抗生素具有较多的基因得到注释，说明它们对这3种抗生素可能具有较高的抗性，与团队之前的研究结果相同[22]。 通过分析L. plantarum PC06与PC108耐药基因所在位置发现，2株菌的质粒上均存在少量耐药基因(表 5)。其中PC06存在6种不同的耐药基因，分别分布在质粒A、质粒B和质粒C上，而PC108仅在质粒B和质粒C上存在3种耐药基因。从ARO描述来看，2株菌质粒上携带的耐药基因都是非植物乳杆菌特有的，可能来自环境中其他细菌。研究表明，大多数益生菌对抗生素的耐药性是固有抗性，是非转移性的，但有质粒的益生菌会存在与结合质粒相关的耐药性发生转移的可能性[24]。因此，由于L. plantarum PC06与PC108的质粒上存在少量耐药基因，理论上存在发生耐药基因转移的可能性，但确切关于菌株耐药性是否有转移风险以及其可能性大小的讨论需进一步研究论证。 2.5 胆盐水解酶相关基因 能在肠道内生存是益生菌在人体内发挥作用的重要指标之一。益生菌在通过胃后会到达十二指肠，在那里将会遇到各种压力条件，包括结合胆汁盐的存在。胆汁盐不仅能分散和吸收脂肪，还能作为表面活性剂破坏细胞膜的完整性，同时还能产生自由基降低细胞内的pH[25]，而胆汁盐能被胆盐水解酶(Bsh)解偶联并在结肠中重新吸收[26]。 L. plantarum WCFS1被证实有较好的胃肠道存活能力，有报道指出其在体外胃肠道存活模型中暴露1 h后，活细胞减少了3个数量级[27]。研究表明L. plantarum WCFS1中有4个被注释为胆盐水解酶的基因(Bsh1、Bsh2、Bsh3和Bsh4)[26]，通过基因目的片段查找发现L. plantarum PC06与PC108同样存在这4个胆盐水解酶基因，并且通过KEGG数据库注释到2个通路类别(表 6)。说明这2株菌可能具有与L. plantarum WCFS1相似的胃肠道存活能力，同时有报道指出胆盐水解酶与胆固醇清除能力有关[28]，可通过减少肠道胆固醇重吸收来降低甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇，有助于控制心血管疾病患者的高胆固醇[29]，但这2株菌的胆固醇降解能力和对于心血管疾病的帮助需进一步验证。 2.6 两株植物乳杆菌在细菌素合成基因簇比较结果 为了适应环境和生存，植物乳杆菌会对其他共生或竞争的微生物作出反应，这种反应称为群体感应，取决于细胞密度的基因表达，这对细菌的存活有着重要意义。细菌素是一种由细菌核糖体合成的具有抗菌活性的多肽，其中，植物乳杆菌素是由植物乳杆菌产生的细菌素，相关抗菌蛋白由pln基因簇编码[30]。 以L. plantarum WCFS1为例，其细菌素得到了充分的研究。该菌细菌素合成基因簇包含5个操纵子的pln基因座，plnABCD编码称为细菌素A (plnA)，操纵子plnEFI和plnJKLR用它们各自的免疫蛋白编码细菌素EF和JK，细菌素随后由操纵子plnGHSTUVWXY编码的ABC转运蛋白和辅助蛋白(PlnGH)转运和分泌[31-32]。 与L. plantarum WCFS1相比，L. plantarum PC06在plnJ和plnN之间插入了1个Na+/H+逆向转运蛋白(与L. plantarum ZJ316相似度为95.83%)，在plnJKLR操纵子中多了1个IS3家族转座酶和1个转座酶InsN，这可能是其他基因片段的转座子带来的，而COG数据库中得到较多转座子相关注释也能进一步佐证，但这对细菌素JK合成是否有影响尚未可知，同时还发现了1个包含67个氨基酸的未知功能假设蛋白，其功能有待进一步研究。L. plantarum PC108的细菌素合成簇则与L. plantarum WCFS1有较大不同，操纵子plnJKLR是相对保守的操纵子，但PC108缺失了plnJ和plnO (糖基转移酶GlyS)的相关基因片段，这可能会影响细菌素JK的合成。同时，PC108的操纵子plnJKLR上多出了1个包含61个氨基酸的核心肽，通过UniRef90比对发现这是1个具有双苷氨酸前导的IIb类细菌素lactobin A。有研究报道指出lactobin A首次被发现是由Lactobacillus amylovorus LMG P-13139产生，其抑菌谱较窄，对Lactobacillus delbrueckii subsp.最有效[33]。除此之外，PC108的编码蛋白plnG有一部分发生了氨基酸突变，突变区域与正常plnG的相似度为97.682%，由其中基因编码蛋白功能可知，此操纵子功能与细菌素的转运有关，这可能会影响细菌素的转运功能(图 8)。 2.7 两株植物乳杆菌益生特性相关基因 L. plantarum PC06和PC108的潜在益生特性在团队前期的研究中得到证实[22]，同时在全基因组分析数据中得到了支持。本研究中检测与酸耐受性相关的基因F0F1 ATP合成酶与胆盐抗性相关的胆盐水解酶(BSH)的基因(表 7)。益生菌在工业化生产过程中可能会遭受高/低温胁迫，暴露与高温环境中可诱导保守的热休克蛋白(HSPs)的表达，例如GroES、GroEL、GrpE、DnaK和DnaJ。在多种微生物中都发现了冷休克蛋白相关基因，并且这些基因与细菌在低温下存活的适应过程相关[34]，在L. plantarum PC06和PC108染色体上发现了CSP家族的冷休克蛋白基因。此外，L. plantarum PC06和PC108全基因组中还检测出过氧化氢酶相关基因、硫基过氧化酶相关基因和谷胱甘肽过氧化酶相关基因，这些酶可以防止氧化应激。 3 讨论与结论 四川泡菜是一个天然的微生物资源库，有大量有价值的微生物值得研究。本研究收集了四川多代泡菜母水样本，从中分离筛选出13株具有潜在益生特性的植物乳杆菌，其中包括L. plantarum PC06和PC108。在前期筛选阶段发现这2株菌表现出了较好的耐酸耐胆盐、胃肠液耐受性和自聚集共聚集能力，并且具有较好的安全性[22]。在此基础上对这2株菌进行的全基因组测序和基因组功能解析。通过系统发育树和ANI分析结果发现，L. plantarum PC06和PC108基因组存在差异，ANI为99.08%，在系统发育树中分支距离较远。 使用CAZy、KEGG和COG数据库注释结果表明，L. plantarum PC06和PC108得到了相近的基因注释数量，并且2株菌在碳水化合物利用、氨基酸利用和糖基转移酶等功能上得到了大量的注释，这意味着其可能具有较强的碳水化合物利用能力，为菌株在各种环境中的生存能力提供了基础；VFDB和CARD数据库比对结果表明，大部分得到注释的基因并非能够直接导致人体致病的相关基因，其中仅有的2种与溶血性相关的基因也在前期研究中证实并未表达，而PC06与PC108的质粒上带有极少量的耐药基因，理论上存在转移的可能性，需后续研究严重。除此之外，L. plantarum PC06和PC108均携带了4个与胆盐水解酶(Bsh)相关的基因片段，比对相似度均为98.6%，这意味着这2株菌具有耐受胃肠液的潜力。另外，我们还发现这2株菌均有完整的细菌素合成基因簇，其中L. plantarum PC06与L. plantarum WCFS1的细菌素合成基因比较相似，而L. plantarum PC108的缺失了合成plnJK的部分基因片段，但有一个IIb类细菌素lactobin A的相关基因嵌入到了操作子plnJKLR中，这意味着L. plantarum PC108产生的细菌素可能与PC06和WCFS1有差异，具体功能有待进一步研究。最后，我们汇总了L. plantarum PC06和PC108中与各种胁迫相关的基因，为其在人体内发挥益生特性提供了基础。 综上所述，本研究通过分离筛选与全基因组测序得到了2株泡菜源植物乳杆菌的全基因组信息，并且通过与L. plantarum WCFS1的比较分析，发现了与胆盐水解酶和与具有抗菌活性的细菌素合成基因簇，说明这2株菌能够作为具有潜在益生特性的益生菌菌株，具体益生功能还需进行进一步研究，如转录组学和蛋白质组学研究，将使我们能够阐明所鉴定的基因在细菌存活、宿主定殖和抗菌活性等的生理学重要性。本研究从基因层面揭示了L. plantarum PC06和PC108的潜在益生机理，为今后筛选优良益生菌菌株和基因层面上益生特性评价提供遗传学基础。